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蛋白定量BCA法VS Bradford法，你支持哪一种？
5934 人阅读发布时间：2021-04-07 10:12
精确的蛋白质定量是蛋白质相关实验所必需的，这些实验涉及分子生物学，细胞生物学，生物化学，发育生物学和神经科学的研究课题。依托不同的科学原理，目前已经发展出多种不同的蛋白测定方法，科研工作者广泛使用的方法比如紫外吸收法（UV），双缩脲法，考马斯亮蓝法（Bradford）、Folin-酚试剂法（Lowry）、BCA（Bicinchoninic Acid）法、凯氏定氮法等等，各有千秋。今天小编就BCA法，Bradford法，2种常见蛋白定量方法的原理、优缺点以及BCA法实验操作步骤给大家做详细介绍，看看哪一种方法能获得你的支持？
2、特点：
恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管
4、实验操作：
1、原理：Bradford法也称作考马斯亮蓝法，是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是，带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue G250），是一种甲基取代的C19H16，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由游离状态下的棕红色变为蓝色。并且在一定浓度范围内，稳定的染料-蛋白复合物的OD值与蛋白质含量呈线性关系。通过分光光度计或者酶标仪以标准品蛋白做标准曲线，随后检测目标蛋白595nm波长处的吸光值，即可换算出目标蛋白浓度。
2、特点：
通过以上两种蛋白定量的方法的对比，我们可以发现对于BCA法和Bradford法，每一种方法都有自身的优势和缺陷，因此针对同一样本采用不同的方法进行检测，检测结果也可能出现偏差。所以我们在使用时，应当根据实验条件挑选最合适的检测方法，这样实验数据才会更可靠!
三、产品推荐
欢迎任何形式的媒体与商务合作深入的了解，有利于为您提供更优质的服务！
联系地址： 武汉光谷生物医药加速器17号楼1号房2-3层
联系电话： +86-027-59716789
电子邮箱： service@abbkine.com
提示： 本公司所有产品仅供实验科研使用，不用于人体及临床诊断；
一、BCA（Bicinchoninic Acid）法
1、原理：BCA (bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，562nm处有最高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
2、特点：
- BCA蛋白质测定方法灵敏度高，操作简单，正常情况下可在45分钟内完成测定；且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线。
- 灵敏度：例如Abbkine的定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒（BCA法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，最低检测蛋白量达到0.5ug。
- 优点：BCA方法适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测，可兼容高达5%的SDS，TritonX-100及Tween等。
- 缺点：由于BCA方法依靠铜离子进行显色反应，如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTT、TCEP和β-巯基乙醇等，结果将受到很大程度的影响。此外，BCA方法的检测结果也会受到蛋白质内半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影响。
恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管
4、实验操作：
- 标准液制备：梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。将8个EP管按照1到8进行标记，将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液，准备浓度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。
- BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）
- 加样孵育：吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品，加入96孔板底部或试管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。在37°C下孵育30min，冷却至室温。
- 测定：冷却到室温后，以空白为对照，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值
- 将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。
- 在excel表中输入对应的标准曲线值和蛋白样品值。（图中所示均为举例说明，具体数据请参照个人实际实验结果），选定标准曲线的OD值和标准品蛋白浓度。
- 点击excel表栏：插入-图表-XY散点图，并点击确定。
- 点击确定后会自动生成XY散点图，随意点击散点图中的任一的散点，右键添加趋势曲线。
- 点击趋势线的拓展栏，选择“更多选项”。
- 选择“更多选项”，弹出“设置趋势图格式”的画面，点击“显示公式（E）”以及“显示R平方值”。一般R2值越接近1，表现标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确，一般要求为0.99几左右。
- 将样品OD值代入标准曲线的公式中，计算即得到待测样品蛋白的浓度。
二、考马斯亮蓝法（Bradford）
1、原理：Bradford法也称作考马斯亮蓝法，是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是，带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue G250），是一种甲基取代的C19H16，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由游离状态下的棕红色变为蓝色。并且在一定浓度范围内，稳定的染料-蛋白复合物的OD值与蛋白质含量呈线性关系。通过分光光度计或者酶标仪以标准品蛋白做标准曲线，随后检测目标蛋白595nm波长处的吸光值，即可换算出目标蛋白浓度。
2、特点：
- 简单便捷：仅需一种反应试剂即可完成检测，操作十分便捷，完成一个样品的测定只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好，不用考虑时间的限制。
- 灵敏度：例如Abbkine的蛋白质定量试剂盒（Bradford法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，最低检测蛋白量达到0.5ug。反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。
- 优点： Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K+ 、Na+ 、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巯基乙醇等。
- 缺点：由于蛋白-染料稳定复合物之间是分子间作用力，故Bradford法会受到表面活性剂如：去污剂、0.1N的NaOH 、SDS、Triton X-100，Tween 20等的干扰。除此之外，不同靶标蛋白中碱性氨基酸（范德华力作用）以及芳香族氨基酸（疏水作用）含量不一，对考马斯亮蓝的结合能力差异较大；而且随着蛋白浓度增加，线性关系会出现偏差。
- 由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于0.1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％。
- 检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250，G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。
通过以上两种蛋白定量的方法的对比，我们可以发现对于BCA法和Bradford法，每一种方法都有自身的优势和缺陷，因此针对同一样本采用不同的方法进行检测，检测结果也可能出现偏差。所以我们在使用时，应当根据实验条件挑选最合适的检测方法，这样实验数据才会更可靠!
三、产品推荐
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 蛋白质定量试剂盒（BCA法） | KTD3001 | 500T/2000T/5000T |
| 蛋白质定量试剂盒（Bradford法） | KTD3002 | 500T/2000T/5000T |
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